单细胞 RNA-seq 学习路线

1. 筛选队列并对齐元数据

输入：GEO raw UMI RDS 与细胞注释文件。

• 验证细胞/基因 ID 唯一、counts 合法、22 个目标样本齐全，再按 Index 对齐矩阵列与注释。
• 根据原始实验记录填写 sample-design.csv 的 capture_id 和 capture_evidence。仅完成描述性项目时 donor_id 可留空；不要从样本数字后缀推断配对。

Rscript gse131907-practice.R import

交付物：lung-raw.rds、sample-design.csv、cohort-counts.csv、input-audit.txt。

自检要求

• 元数据行名与矩阵列名完全同序一致。
• 没有默认为 N01/T25 配对；所有未核实的供体信息明确记为未知。

2. 先看 QC 分布，再确定阈值

输入：lung-raw.rds。

• 逐样本查看 QC-before.pdf 和 qc-metrics.csv，确认 MT- 与明确列举的血红蛋白基因集是否检出。
• 复核 qc-settings.csv：根据分布和生物学调整阈值并填写 reason。初值为 genes >200/<6000、UMI >200/<40000、mt <20%、血红蛋白 <5%，仅作为教学起点。

Rscript gse131907-practice.R qc-audit

交付物：QC-before.pdf、qc-metrics.csv、qc-settings.csv、qc-gene-sets.txt。

自检要求

• 阈值均有理由，没有静默丢弃整个样本。
• 不为凑齐文献细胞数而删除真实红系生物学信号。

3. 应用 QC，并按捕获批次检查双细胞

输入：已复核的 QC 参数，以及捕获 ID/证据。

• 捕获信息缺失时脚本会停止。核实多个样本是否共用一次捕获、一个样本是否跨多次捕获；后一种情况需先补细胞级捕获映射，不能直接用本脚本的一样本一捕获表。
• 逐样本、逐捕获查看保留量与 doublet 预测。scDblFinder 的 singlet 不是绝对保证。

Rscript gse131907-practice.R clean

交付物：lung-clean.rds、qc-decisions.csv、doublet-decisions.csv、retention.csv、QC-after.pdf。

自检要求

• 每个保留细胞都能追溯到 QC 和 doublet 决定。
• 解释样本间异常损失，不以精确复现文献细胞数为验收标准。

4. 构建表示并整理 marker 证据

输入：lung-clean.rds。

• 使用不强制回归生物评分的 SCT、PCA、20 PC 邻居图与 0.3 分辨率作为起点，检查 PC 诊断与样本/组别分布。
• 结合 markers.csv 和 marker-evidence.pdf，为 annotation-review.csv 的每个 cluster 填写 celltype、evidence、reviewed=TRUE；冲突时保留 uncertain，不照搬原文 0–17 标签字典。

Rscript gse131907-practice.R cluster

交付物：lung-clusters.rds、embedding.pdf、pca-diagnostics.pdf、markers.csv、marker-evidence.pdf、annotation-review.csv。

自检要求

• 注释说明阳性/阴性 marker 和组织背景。
• 在报告记录 PC/分辨率敏感性；不把 UMAP 分开直接解释为疾病效应。

5. 选修：Harmony 与未校正 PCA 对照

选修拓展

输入：lung-clusters.rds 和批次/生物学混杂评估。

• 说明 Sample 为什么可能包含技术差异，又在哪里与 group 混杂。
• 比较分别保存的两个 UMAP。本分支不替换主线聚类或注释；若接受整合后的重新聚类，必须重新核查 marker。

Rscript gse131907-practice.R harmony

交付物：lung-harmony-comparison.rds、harmony-comparison.pdf。

自检要求

• 两个 embedding 均存在，评估时考虑 marker 生物学信号。
• 不宣称 Harmony 生成了校正 counts 或解决供体混杂。

6. 应用注释，逐样本汇总组成

输入：lung-clusters.rds 与完整的 annotation-review.csv。

• 应用人工复核的标签并保存最终对象。
• 检查 annotated-UMAP.pdf、sample-composition.pdf 与 sample-proportions.csv：保留某样本缺失类型的零计数，分母为该样本全部保留细胞。

Rscript gse131907-practice.R compose

交付物：lung-annotated.rds、annotation-decisions.csv、annotated-UMAP.pdf、sample-proportions.csv、sample-composition.pdf。

自检要求

• 所有 cluster 都已复核，包括 uncertain。
• 各样本比例和为 1；整份样本无保留细胞时流程停止，而不伪造全零比例。

7. 结题并列明尚未解决的问题

输入：各阶段产出、决策表与环境日志。

• 撰写 report.md：研究问题、选样逻辑、供体/捕获信息状态、QC 损失、注释依据、样本级组成和局限，并列出与原文的差异。
• 后续如需推断，先获取核实的 donor ID 和协变量，明确配对、模型、独立单位与多重检验方案，再选择检验。信息缺失时，本次提交停留在描述性结果。

交付物：report.md、决策 CSV、图表、最终对象与 session-*.txt。

自检要求

• 每张图交代 assay、分析单位和样本分组。
• 区分 cluster marker 与条件 DE，区分样本级汇总与细胞混池，不称为论文精确复现。